Что такое ПЦР в режиме реального времени
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ, qPCR) – это высокоточный метод молекулярной биологии, позволяющий не только обнаружить возбудитель (ДНК или РНК), но и точно измерить его количество в образце в ходе каждого цикла амплификации. В отличие от классической ПЦР, метод обеспечивает количественный анализ без необходимости проведения электрофореза, что значительно ускоряет получение результатов.
Ключевое отличие ПЦР в реальном времени от обычной методики заключается в возможности отслеживать ход процесса амплификации в реальном времени. Для этого в реакционную смесь добавляется флуоресцентный зонд, который излучает свет при связывании с целевыми фрагментами ДНК. Интенсивность флуоресценции фиксируется фотодетектором амплификатора на каждом цикле, позволяя строить кривую накопления продукта и рассчитывать исходное количество целевой ДНК.
Принцип работы и флуоресцентные зонды
В основе метода лежит ферментативный процесс создания от тысяч до миллионов копий целевых фрагментов генетического кода. Для стандартной ПЦР необходимы исходная ДНК-матрица образца, праймеры, нуклеотиды (dNTP), термостабильная ДНК-полимераза и буфер для амплификации. В случае ПЦР в реальном времени добавляется ключевой компонент – флуоресцентный зонд.
Флуоресцентные зонды подразделяются на две основные группы. Первая группа – молекулы, интеркалирующие двухцепочечную ДНК (SYBR Green, EvaGreen), которые обнаруживают как специфические, так и неспецифические ампликоны. Вторая группа – флуорофоры, связанные с олигонуклеотидами (зонды TaqMan, зонды двойной гибридизации, молекулярные маяки и зонды "скорпионы"), которые обнаруживают только специфические ампликоны.
Флуорофор поглощает энергию света определенной длины волны и повторно излучает свет с большей длиной волны. Существуют донорные (репортерные) и акцепторные (тушители) флуорофоры. При поглощении энергии донорный флуорофор переходит в возбужденное состояние, а при возврате в основное состояние выделяет энергию в виде флуоресценции, которую фиксирует фотодетектор амплификатора.
Преимущества ПЦР в реальном времени
• Высокая скорость анализа: исследование занимает от 1 до 3 часов, так как не требуется этап электрофореза – результат виден прямо во время реакции.• Высокая точность и чувствительность: метод позволяет выявлять единичные копии патогена в образце.
• Количественный анализ: возможность оценить вирусную нагрузку (например, при гепатите или ВИЧ) и провести анализ экспрессии генов.
• Защита от контаминации: все реакции происходят в закрытой пробирке, что исключает риск загрязнения лаборатории продуктами реакции и получения ложных результатов.
• Универсальность: метод применим для работы с ДНК и РНК (в сочетании с обратной транскрипцией – ОТ-ПЦР).
Области применения ПЦР-амплификаторов
Метод ПЦР в реальном времени используется для быстрого обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот в биологических образцах. Основные направления применения включают анализ экспрессии генов, обнаружение мутаций, определение статуса рака, анализ микроРНК, детекцию генетически модифицированных организмов, обнаружение и определение количества бактерий и вирусов, а также измерение вирусной нагрузки.
Благодаря своей универсальности метод широко используется во многих областях исследований: биомедицина, микробиология, ветеринария, сельское хозяйство, фармакология, биотехнология и токсикология. Ярким примером эффективности метода стало быстрое обнаружение вируса SARS-CoV-2 в период пандемии COVID-19.
ПЦР в реальном времени отслеживается благодаря графикам, отображающимся на мониторе подключенного к амплификатору ПК. График отражает кривую накопления продукта ПЦР: в течение первых циклов идет наработка продукта, но его количество не превышает базового уровня. Когда продукт начинает синтезироваться по экспоненте, кривая резко идет вверх – в этот период достигаются оптимальные условия проведения ПЦР. Интенсивность флуоресценции в экспоненциальной фазе используется для расчета данных. Позднее некоторые реактивы начинают ингибировать ПЦР, запасы нуклеотидов заканчиваются, и выработка продукта выходит на плато.
ПЦР-амплификаторы в каталоге
В данном разделе представлены современные системы для проведения ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией от компании Bioer Technology. Оборудование охватывает широкий спектр задач – от портативных решений для небольших лабораторий до высокопроизводительных систем для научных и клинических исследований.
• LineGene 9600 Pro – высокопроизводительная система с 6 каналами детекции, сканированием 96 лунок за 7 секунд и встроенным сенсорным экраном 10,1".• LineGene Mini S – компактный портативный амплификатор с 4 каналами детекции, вращающимся источником света и полноцветным сенсорным экраном.
• QuantGene 9600 – система с 6-зонным независимым контролем температуры, оптоволоконной детекцией и CMOS-сенсором для количественного и качественного анализа.
Все приборы поддерживают работу с различными флуоресцентными красителями и зондами (FAM, SYBR Green, VIC, HEX, ROX, TEXAS-RED, Cy5, Cy5.5 и другими), обеспечивают высокую точность температурного контроля и совместимы с широким спектром расходных материалов